体外皮肤变态反应 氨基酸衍生化反应试验方法

In Chemico Skin Sensitisation: Amino acid Derivative Reactivity Assay (ADRA)

1  体外皮肤变态反应 氨基酸衍生化反应试验方法-范围

本方法规定了氨基酸衍生化反应试验方法的基本要求和方法。

本方法适用于已知单一组分、已知组成成分的多组分化妆品用原料潜在致敏性的评价。

2  体外皮肤变态反应 氨基酸衍生化反应试验方法-试验目的

预测和评价化妆品用化学原料是否具有潜在皮肤致敏性。

3 体外皮肤变态反应 氨基酸衍生化反应试验方法- 定义

3.1  氨基酸衍生物消耗百分比Percent Amino acid Derivative Depletion

与溶剂对照相比，受试物消耗氨基酸衍生物的程度。

3.2  共洗脱 Co-elution

受试物在281 nm处吸收显著，并与氨基酸衍生物保留时间相同或色谱峰部分重叠，干扰氨基酸衍生物定量分析。

4  体外皮肤变态反应 氨基酸衍生化反应试验方法-试验原理

有致敏性的受试物与N-（2-（1-萘基）乙酰基）-L-半胱氨酸（NAC）和N-（2-（1-萘基）乙酰基）-L-赖氨酸（NAL）模拟的皮肤蛋白进行反应，消耗氨基酸衍生物。测定衍生物的量，计算氨基酸衍生物消耗百分比，从而判断受试物是否具有皮肤致敏性。

5 体外皮肤变态反应 氨基酸衍生化反应试验方法- 试验材料与试剂

5.1  氨基酸衍生物片段与纯度

N-（2-（1-萘基）乙酰基）-L-半胱氨酸（NAC）：分子式C15H15NO3S，分子量289.35，纯度：＞98%。

N-（2-（1-萘基）乙酰基）-L-赖氨酸（NAL）：分子式C18H22N2O3，分子量314.38，纯度范围：＞98%。

图1  NAC（左）和NAL（右）的结构式

5.2  阳性对照与受试物的配制

阳性对照溶液：取苯乙醛适量（纯度＞90%），加乙腈制成1 mmol/L的溶液，临用新制。

受试物溶液：溶剂选用蒸馏水、乙腈和丙酮，单一或混合使用制成1 mmol/L的溶液，临用新制。如出现溶解不完全的情况，可将受试物先溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，然后用乙腈稀释该溶液制备成1 mmol/L受试化合物溶液。最终溶液中DMSO用量不得超过5%（V/V）。

反应固定液：1 mL三氟乙酸（TFA）加40 mL水于5 mL离心管中，得到2.5% TFA水溶液。

5.3  氨基酸衍生物贮备液的配制

5.3.1  N-（2-（1-萘基）乙酰基）-L-半胱氨酸（NAC）贮备液：称取适量NAC，用pH 8.0的磷酸盐缓冲液配制成6.667 μmol/L的溶液。储备液应在-80 ℃下冷冻保存，存放时间不超过六个月，每次使用应验证其稳定性。

pH8.0磷酸盐缓冲液：取0.18 g无水磷酸氢二钠与4.02 g无水磷酸二氢钠溶于300 mL蒸馏水当中，每300 mL缓冲液加入1 mL的0.1 mmol/L EDTA溶液，混合均匀，测终溶液pH在7.9-8.1之间，配制完成，每次使用前检查pH。

5.3.2  N-（2-（1-萘基）乙酰基）-L-赖氨酸（NAL）储备液：称取适量NAL，用pH10.2的磷酸盐缓冲液配制6.667 μmol/L的溶液。储备液应在-80 ℃下冷冻保存，存放时间不超过六个月，每次使用应验证其稳定性。

pH10.2磷酸盐缓冲液：取4.26 g无水磷酸二氢钠溶于286 mL蒸馏水，加入14 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，每300 mL缓冲液加入1 mL的0.1 mmol/L EDTA溶液。搅拌均匀，测终溶液pH在10.1-10.3之间，配制完成，每次使用前检查pH。

5.3.3  氨基酸衍生物标准线性溶液的配制

NAC标准线性溶液的稀释溶剂：取15 mL pH8.0磷酸盐缓冲液于50 mL离心管，加1 mL水、100 μL三氟乙酸、3.9 mL乙腈，振荡混匀，临用新制。

NAL标准线性溶液的稀释溶剂：取15 mL pH10.2磷酸盐缓冲液于50 mL离心管，加1 mL水、100 μL三氟乙酸、3.9 mL乙腈，振荡混匀，临用新制。

先配制5 μmol/L的标准溶液（std7）：300μL 6.667 μmol/L NAC储备液加入1.5 mL离心管中，加入20 μL水、2 μL三氟乙酸、78 μL乙腈。

    标准线性溶液：取std7溶液，逐步稀释到下表浓度。std1为稀释溶剂。NAL线性溶液操作步骤与NAC一致。

表1  线性点的摩尔浓度

5.3.4  液相待测溶液的配制

共洗脱对照：150 μL磷酸盐缓冲液+50 μL受试物溶液。

参比溶液A和B：150 μL NAC+50 μL 乙腈，平行样A三份B六份。NAL的操作步骤一致。

参比溶液C：150 μL NAC+50 μL溶解受试物的溶剂，平行三份。若用混合溶剂，则需要制备每种溶剂的参比溶液C；如用乙腈和水混合溶液溶解的，则需要配制三份NAC的水溶液，三份NAC的乙腈溶液。NAL的操作步骤一致。

阳性对照溶液制备：150 μL NAC+50 μL阳性对照（苯乙醛乙腈）溶液，三份平行样。NAL的操作步骤一致。

供试品溶液制备：150 μL NAC+50 μL测试化学品溶液，三份平行样。NAL操作步骤一致。

6  体外皮肤变态反应 氨基酸衍生化反应试验方法-试验步骤

6.1  操作步骤

按进样顺序排列，5.3.4项下所有对照与测试样品均避光25±1 ℃反应24±1 h，结束后30 min内加入反应固定液50 μL，观察反应前后是否产生沉淀。（如果反应前产生沉淀，阳性结果可用，阴性不可用；反应后产生沉淀，过滤后再进样。）

6.2  液相色谱条件

6.2.1  流动相

流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液（V/V），1 mL三氟乙酸+1000 mL水，混匀既得；

流动相B：0.1%三氟乙酸乙腈溶液（V/V），1 mL三氟乙酸+1000 mL乙腈，混匀既得。

6.2.2  色谱柱

十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（3.0 mm×150 mm，2.7 µm）或等效色谱柱。

6.2.3  检测器及检测波长

紫外吸收光谱检测器，检测波长为281 nm，流速0.3 mL/min。

NAC/NAL流动相梯度洗脱程序（可依据实际情况调整）：

7  体外皮肤变态反应 氨基酸衍生化反应试验方法-数据处理

氨基酸衍生物消耗百分比计算公式：

注：当氨基酸衍生物消耗值计算为负时，视为“0”值。

8  体外皮肤变态反应 氨基酸衍生化反应试验方法-试验成立条件

符合以下条件，试验条件有效：

8.1  标准曲线：r2 > 0.990。

8.2  阳性对照平均氨基酸衍生物消耗百分比：NAC：6%～30%，SD（百分数表示，下同）＜10%。NAL:75%~100%，SD＜10%。

8.3  受试物氨基酸衍生物消耗值SD：NAC小于10%，NAL小于10%。

8.4  参比溶液A的NAC/NAL平均浓度：3.2 μmol/L～4.4 μmol/L。

8.5  参比溶液C的NAC/NAL平均浓度：3.2 μmol/L～4.4 μmol/L。

8.6  参比溶液B、C峰面积RSD%＜10%（n=9），每种溶剂对照C峰面积RSD%＜10%（n=3）。

8.7  NAC或NAL稳定性：ST（0 h）与ST（24 h）浓度相差≤10%。ST（0 h），NAC或NAL的初始浓度；ST（24 h），反应24±1 h后NAC或NAL的浓度。

9  体外皮肤变态反应 氨基酸衍生化反应试验方法-结果判定标准

9.1  当受试物与NAC和NAL都不发生共洗脱时，采用1:50 NAC和1:50 NAL模型（表2）判定。

表2  1:50 NAC和1:50 NAL判定模型

9.2  当受试物仅与NAL发生共洗脱时，采用1:50 NAC模型（表3）判定。

表3  1:50 NAC判定模型

9.3  当受试物同时与NAC、NAL发生共洗脱或者与NAC单独共洗脱时，判定结论为“无定论”。

10  体外皮肤变态反应 氨基酸衍生化反应试验方法-注意事项

10.1.  采用1:50 NAC和1:50 NAL模型时，NAC和NAL消耗百分比的均值在3%-10%之间；采用1:50 NAC模型时，消耗百分比在4%～11%之间，须进行重复测试；若前两次结果不一致，须再次测试。

10.2  在对已知组分的多组分化妆品用化学原料进行试验时，可根据各组成成分（除水以外）的平均分子量进行1 mmol/L样品的配制。

10.3  若受试物在建议溶剂中的溶解度达不到1 mmol/L，理论上仍可以进行试验。在这种情况下得出的阳性结果仍有参考意义，但得出的阴性结果不能说明受试物一定没有致敏性。若一种受试物能在不同溶剂溶解度当中达到1 mmol/L，不同溶剂的溶解形成的溶液实验数值可能不同。实际选择溶剂时应考虑溶液的稳定性。

10.4  液相进样序列建议参照表4执行。建议选用带有温度控制的样品盘，温度设置在4 ℃，并且序列运行时间尽量控制在30 h之内。

表4 液相进样序列